Consell Superior d'Investigacions Científiques (CSIC). Delegació de Catalunya.

Un peix d’aquari i de… laboratori!

El peix zebra és un peix tropical d'aigua dolça que gaudeix de certa popularitat entre els amants dels aquaris. Fa poc més de tres dècades va ser escollit com a espècie model per a la recerca en biologia del desenvolupament i en genètica. Des de llavors, centenars de laboratoris a tot el món estudien aquest peix que també ha resultat ser molt útil per comprendre la biologia humana.

Genèticament està més pròxim a l'espècie humana que la mosca del vinagre o el cuc i és més fàcil de manipular i de mantenir i criar que el ratolí. El 2002, el Wellcome Trust Sanger Institute, va publicar a Internet el primer esborrany de la seqüència del seu genoma, que conté uns 17.000 gens.

Es comporta el peix zebra de laboratori igual que el que viu al riu?

La vida tropical d'un peix de laboratori

El peix zebra, en llatí Danio rerio, és un peix petit i actiu, natiu de l'Índia, que sol habitar els rius d'Àsia central. Va ser escollit entre la gran diversitat de peixos existents a la natura per entrar al laboratori. Però, no es va haver d'anar a pescar al riu, doncs, com altres espècies del mateix gènere, és una espècie habitual dels aquaris. A més a més, és coneguda perquè és fàcil de mantenir, és bastant resistent a variacions en les condicions del medi, i pot conviure amb moltes espècies. Malgrat el seu ús estès a aquaris i laboratoris, encara avui es desconeixen molts aspectes de l'hàbitat natural i de l'ecologia de l'espècie.

La popularitat aconseguida en l'aquari li va valer l'accés al laboratori?

Un peix ratllat

És una espècie de mida petita, la longitud dels adults sol ser entre 3 i 5 centímetres (cm), i 1 cm d'ample, en funció de les condicions ambientals. Té una forma allargada amb una aleta dorsal. Als laterals presenta entre 5 i 9 bandes de color blavós que se superposen al color de fons que, en els mascles, és daurat i, en les femelles, és platejat. Aquest aspecte ratllat li ha merescut el nom popular de peix zebra. La zona ventral és de color blanquinós i rosat.

Com un peix a l'aigua

Habita en aigües més o menys tranquil·les, i en ocasions estancades, d'Àsia central, especialment, de la regió del Ganges a l'Índia. També es pot trobar en els rius del Nepal, Bangla Desh, Pakistan i Myanmar. És un animal omnívor que s'alimenta de larves de mosquit i d'altres espècies d'insectes (zooplàncton), i també d'algues microscòpiques (fitoplàncton). A l'aquari les condicions tenen una temperatura entre 22 i 30 ºC, de pH de l'aigua neutre (al voltant de 7) i una duresa de l’aigua de 5 a 10 dGH.

Entre amics i enemics

Pertany a la família dels ciprínids (Cyprinidae) i està emparentat amb la carpa. És un animal pacífic que forma petites agregacions d'individus i mostra un comportament social. Conviu amb altres espècies del mateix gènere, com el danio puntejat (Danio nigrofasciatus), el danio blau (Danio kerri) o el danio rosat (Danio roseus), i d'altres gèneres com el danio gegant (Devario aequipinnatus), la Danionella translucida i el peix agulla (Microphis sp). Entre els possibles depredadors d'aquesta espècie hi ha els cap de serp (Channa sp.) i l’agulla d’aigua dolça (Xenentodon cancila). Conèixer les relacions ecològiques i condicions naturals en què viu aquesta espècie és important per a qualsevol intent d'entendre l'evolució o la funció dels trets fenotípics.

Cicle de vida

En condicions naturals l'època d'aparellament es produeix aproximadament entre els mesos d'abril i agost. És una espècie ovípara i la posta d'ous té lloc als marges dels rius. Els ous solen eclosionar passats tres dies des de la fertilització i, als cinc o sis mesos, els individus arriben a la maduresa reproductiva. Al laboratori les femelles poden posar entre 200 i 300 ous per posta, el desenvolupament embrionari té lloc a 24 hores i les larves comencen a alimentar-se independentment als cinc dies. En condicions òptimes, el temps de generació d'ou a ou és de tres mesos.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

Imatge d'un peix zebra (Danio rerio) on es veuen bé les bandes laterals del cos que li donen el nom. Foto: Marrabbio2. Font: Wikimedia Commons: http://commons.wikimedia.org. Aquesta imatge és de domini lliure per a qualsevol propòsit, sense cap condició llevat d'aquelles requerides per la llei.

Un més al "club dels modèlics"

El peix zebra és una de les recents incorporacions al club selecte dels organismes model. Això es deu en gran part a l'esforç i la dedicació de George Streinsinger (1927-1984) qui, a la dècada de 1970 des de la Universitat d'Oregon, va proposar l'ús d'aquest peix per estudiar certs processos complexos de la biologia com el desenvolupament i el sistema nerviós. Aquest investigador, que havia treballat durant molts anys amb fags (virus dels bacteris), pretenia traslladar el treball realitzat amb els fags al petit vertebrat. El peix zebra, però, només va aconseguir definitivament un lloc al laboratori durant les dècades de 1980 i 1990.

El peix zebra es va adaptar al laboratori o va ser al revés?

Aficionat dels aquaris

George Streisinger era un gran aficionat dels aquaris. Però es tractava d'un amateur força singular, ja que, la seva formació com a biòleg molecular li va permetre identificar el peix zebra com a possible candidat per a dur a terme experiments al laboratori. Aquesta espècie reunia, d'una banda, la facilitat de manteniment, la gran progènie i la transparència dels embrions, i de l'altra, plantejava la possibilitat de manipular de manera bastant fàcil i econòmica un animal "complex", si es compara amb les dificultats i costos de treballar amb el ratolí.

Del virus al peix

George Streisinger treballà durant molts anys en la genètica de bacteriòfags, especialment en els virus T4 dels bacteris. Entre altres aspectes, va contribuir a establir l'estructura del genoma del fag i a desxifrar el codi genètic. Posteriorment, com molts genetistes de virus, es va interessar per sistemes biològics més complexos. En aquest marc, el peix podia contenir un bon nivell de complexitat, ja que es tracta d'un vertebrat i, per tant, és més proper a l'ésser humà que la mosca del vinagre o el cuc Caenorhabditis elegans, encara que és més distant que el ratolí.

Adaptar-se al laboratori
George Streisinger pretenia aplicar al peix la mentalitat amb la qual s'estudiava els fags. És a dir, generar mutacions visibles en l'aspecte físic que després fos possible analitzar genèticament. Per a això, va haver de posar a punt tot un repertori de tècniques d'experimentació que facilitessin la mutació, la producció de clons homozigots i l'anàlisi genètica. També els mètodes per a la identificació de mutants entre la descendència partenogenètica (els descendents que s'han format només amb l'ou de la femella) de femelles mutageneïtzades

El peix es guanya la fama
Els resultats de l'empresa científica amb el peix zebra no van ser immediats. Als anys 1981 i 1983, prop deu anys després d'haver començat a treballar amb aquest animal, Streinsinger publicà diversos articles que donaren a conèixer els primers resultats de l'ús del peix zebra com a material d'experimentació. Els articles tractaven sobre la producció de clons homozigots i la inducció de mutacions amb raigs gamma a les cèl·lules embrionàries de peix zebra. Van ser publicats a les revistes científiques Nature i Genetics, respectivament, i serviren per donar a conèixer els avantatges que oferia un petit peix tropical a la investigació biològica.

Buscant mutants

L'any 1989 es va publicar un treball sobre el desenvolupament de la retina pigmentada de l'ull del peix zebra. Va sortir a la llum pocs anys després de la mort de George Streisinger però era resultat de la investigació que ell havia dirigit i de l’entusiasme que havia transmès a companys i col·laboradors. La consolidació del peix zebra com a organisme model es va produir a la dècada de 1990 amb els treballs de Christiane Nüsslein-Volhard (Töbingen, Alemanya), i de Wolfang Driever i Marck Fishman (Boston, Estats Units) d'identificació de mutants que afectaven el desenvolupament embrionari. El camp de recerca del peix zebra s'havia expandit a banda i banda de l'Atlàntic.

Big screen
Els treballs de Christiane Nüsslein-Volhard, i de Wolfang Driever i Marck Fishman es van donar a conèixer el 1996 amb la publicació a la revista Development d'una monografia especial amb 37 treballs sobre el peix zebra i més de 4.000 mutants: Big Screen. S'havien buscat un ampli ventall de mutacions que alteraven el desenvolupament i, amb això, es podia tenir una primera idea del paper del gen en el desenvolupament normal. Però la mutació visible a l'embrió no permet esbrinar de quin gen es tracta. D'aquí la rellevància de la genòmica que aleshores començava a agafar el vol.

Ser transparent

Disposar d'embrions transparents és un dels somnis dels investigadors en biologia del desenvolupament. Els embrions de peix zebra ho són i, per tant, era una de les característiques que feia especialment interessant a aquest organisme. Els embrions permeten observar totes les fases que se succeeixen durant el desenvolupament embrionari i, per Streisinger i els seus deixebles, resultaven summament atractius per estudiar el desenvolupament del sistema nerviós. Un altre aspecte important és el fet que en 24 hores han desenvolupat tots els òrgans i els teixits.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

Portada de la revista Development el desembre de 1996 (Vol. 123 (1)) amb una monografia del peix zebra: http://dev.biologists.org/content/123/1.toc. Reproduït amb el permís de Development: http://dev.biologists.org

L'èxit del peix de laboratori

El peix zebra és l'objecte d'investigació de centenars de laboratoris i milers d'investigadors a tot el món. Es considera una peça clau en recerca biomèdica i ambiental perquè comparteix un remot origen comú amb els humans fa 400 milions d'anys, perquè el seu manteniment és relativament econòmic i perquè pot ajudar a reduir l'experimentació amb mamífers. La jove promesa de la investigació que era aquest peix al 1980 ha aconseguit una posició còmoda al costat d'organismes amb més tradició com la mosca del vinagre i el ratolí. Si bé, la publicació de la seqüència del seu genoma ha arribat amb un cert retard, ja que només recentment (2008) s'ha obtingut una versió gairebé completa.

Què té de "natural" el peix de laboratori?

Aquaris al laboratori

En un tanc de 20 litres es pot criar un centenar de peixos. Cada femella pot posar 300 ous per posta amb una periodicitat diària, setmanal o quinzenal, depenent de les condicions del laboratori. Els embrions mesuren menys d'un mil·límetre i en una sola placa, dispositiu utilitzat per a l’observació d’embrions, en caben molts. A les 24 hores s'han desenvolupat i es poden reconèixer la major part dels òrgans dels individus. Als cinc dies les larves són mòbils i han acabat de consumir la majoria del vitel i comença l'alimentació exògena. Aquesta característica és important perquè sota l'actual legislació sobre experimentació animal un peix es considera animal a partir que comença l'alimentació exògena. Amb el cas del peix zebra s'ha fixat que això succeeix a partir dels cinc dies del desenvolupament. Per tant, l'ús d'embrions de peix zebra fins a aquest moment -és el període en què es realitzen la majoria dels assaigs- es considera un mètode alternatiu i no experimentació animal.

Peixos fluorescents i transgènics
Els embrions transparents del peix zebra també es poden utilitzar per estudiar la morfologia i la fisiologia de determinats grups de cèl·lules mitjançant sondes i anticossos fluorescents a partir de tècniques de tinció immunohistoquímica i hibridacions in situ. Una tècnica més sofisticada és inserir en els embrions construccions transgèniques que porten una proteïna fluorescent (Proteïna Verd Fluorescent, PVF o GPF en les seves sigles angleses, extreta de la medusa Aequorea victoria) unida a un seqüència específica d'ADN (promotor) del teixit que es vol observar (muscular, tiroide, línia lateral). Les construccions PVF-promotor es denominen transgens i els animals que les porten són animals transgènics. El promotor és un tros d'ADN que actua com un interruptor, activant o desactivant l'acció d'un gen. Aquestes construccions o transgens permeten veure les diferències entre peixos normals i peixos en els quals la funció d'un gen ha estat alterada

Fàrmacs i tòxics

El peix zebra com a material d'experimentació permet la identificació sistemàtica de nous fàrmacs, l'observació i anàlisi dels efectes de fàrmacs i productes tòxics de tot l'organisme. Per aquesta raó, en els camps de la farmacologia, la toxicologia i l'ecotoxicologia, aquesta espècie es planteja com un pas intermedi eficaç en el procés de desenvolupament de fàrmacs i com un sistema molt fi per a detectar els efectes toxicològics tant dels productes de nova síntesi com dels contaminants emergents del medi ambient.

Identificar nous fàrmacs
La reduïda dimensió dels embrions de peix zebra fa que sigui possible analitzar una extensa col·lecció de molècules candidates a ser un nou fàrmac. Així doncs, amb l'ús del peix zebra es pot agilitzar una de les fases més àrdues del procés de desenvolupament de fàrmacs que és la d'identificar les molècules candidates. A més a més, aquestes anàlisis es realitzen en un sistema viu i permeten veure els efectes en tot l'organisme. El que permet, d'una banda, superar les limitacions dels tests cel·lulars que no sempre reuneixen les condicions "in vivo" i, de l'altra, eviten haver de recórrer a l'ús de mamífers en fases primerenques del desenvolupament de fàrmacs, alhora que resulten més econòmics.

Productes tòxics a l'ambient
El peix zebra s'utilitza per l'anàlisi dels efectes subletals dels contaminants emergents, que poden ser greus per a la supervivència de les espècies o la salut humana. Els fibrats, per exemple, són fàrmacs reguladors lipídics que després del seu consum per l'ésser humà passen a les aigües superficials. Com que aquestes substàncies no son eliminades eficientment a les depuradores, s’està començant a considerar els seus efectes sobre els éssers vius. De fet, experiments fets al laboratori mostren que en medis rics en clofibrats s’indueix una síndrome de mala absorció de lípids en embrions de peix zebra. D'altra banda, també s'utilitza aquesta espècie per estudiar aquells contaminants que destrueixen específicament els neuromasts de la línia lateral de les larves. Aquesta estructura és essencial per l'equilibri i per a la detecció de preses i predadors, i poden ser detectats, “in vivo” o “post-mortem”, amb marcadors selectius d'aquesta estructura. També es poden marcar les neurones motores per veure l'efecte que produeix l'exposició a compostos neurotòxics com la cafeïna o nicotina.

Regenerar teixits

A diferència dels mamífers, el peix zebra té la capacitat de regenerar alguns teixits com el teixit nerviós, el teixit del cor, de la retina o de l'oïda. Investigar els mecanismes que actuen al procés regeneratiu desplega noves oportunitats per a la reparació de teixits lesionats en humans. Cal tenir en compte com s'ha mantingut l'activitat regenerativa en la línia evolutiva dels vertebrats i establir, mitjançant anàlisis genòmiques, els gens implicats en aquest procés. La idea és que es podria actuar sobre les gens ortòlegs en mamífers per "reactivar" l'activitat regenerativa que s'ha perdut.

Sistema model per a estudis de funció i regulació gènica

El peix zebra s'ha convertit també en un excel·lent organisme per fer estudis genòmics de rellevància per la salut humana. Ja que tots els vertebrats es construeixen de manera similar durant les primeres fases del desenvolupament embrionari, aquest model permet estudiar la funció de gens implicats en processos que tenen lloc durant el desenvolupament primerenc de tots els vertebrats, entre ells els humans. També s'ha revelat com un potent sistema per dur a terme estudis de regulació gènica "in vivo". Les seqüències de regulació cis (control a nivell del mateix cromosoma) controlen on i com els gens es transcriuen i poden activar (enhancers) o reprimir (silenciadors) l'expressió gènica. Generant peixos transgènics en què aquestes seqüències controlen l'expressió de la proteïna Green Fluorescent Protein (GFP), es pot visualitzar "in vivo" l'activitat d'aquestes seqüències reguladores.

La memòria dels peixos

El peix zebra és un animal social, és a dir, que acostuma a estar en presència d'individus de la mateixa espècie. Per això pot ser útil per a investigar la genètica del comportament. A més a més, té un comportament diürn que permet fer les mesures en el temps natural d'activitat. En l'adult s'estan investigant les bases moleculars del comportament de recerca de recompensa com a punt de partida per a les addiccions i qüestions relacionades amb l'aprenentatge i la memòria. A nivell de larva, la captura de preses serveix per estudiar comportaments simples com la locomoció i la visió.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

Vista dorsal d'un embrió d'una línia transgènica de peix zebra amb expressió de GFP en el marge de les aletes i expressió de RFP en els músculs. Foto: José Luís Gómez-Skarmeta. Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CSIC-UPO).

El 2001 es va començar a seqüenciar el genoma del peix zebra a iniciativa del Wellcome Trust Sanger Institute de Cambridge. El 2002 es va fer públic el primer esborrany i des de llavors s'han actualitzat diverses vegades fins a aconseguir en l'actualitat un 85-90% del genoma complet (tot l'ADN no repetitiu està seqüenciat amb un error de 1-50.000 bases). S'estima que conté 1.700 milions de parells de bases (Mb) que corresponen a uns 14.000 gens, dels quals en comparteix prop del 80% amb els humans. La informació genòmica d'aquesta espècie es reuneix en diferents plataformes, com la base de dades Zebra Fish Information Network (ZFIN), que permeten als membres entendre i caracteritzar els mutants.

1970s

George Streinsinger proposa l'ús del peix zebra com a organisme model en ciències de la vida (a principis de la dècada de 1970).

1981

George Streinsinger produeix clons homozigots en el peix zebra.

1983

George Streinsinger et al. publica un parell d'articles a Genetics sobre la inducció de mutacions amb raigs gamma en les cèl lules embrionàries de peix zebra.

1989

Es publica un estudi clau sobre el desenvolupament de la retina de l'ull del peix zebra.

1994

S'identifica molecularment la mutació "no tail" ("sense cua").

1996

Christiane Nüsslein-Volhard, i Wolfang Driever i Marck Fishman publiquen Big screen, un treball de producció sistemàtica de mutacions letals en embrions.

2001

Wellcome Trust Sanger Institute inicia el projecte de seqüenciació del genoma del peix zebra.

2002

Es publica el primer esborrany del genoma del peix zebra al qual han seguit diverses revisions i actualitzacions.