Consell Superior d'Investigacions Científiques (CSIC). Delegació de Catalunya.

El llevat de la cervesa i... del laboratori

Conegut des de l’antiguitat, el llevat del pa, del vi i de la cervesa, Saccharomyces cerevisiae, ha esdevingut també un organisme usual a la investigació de laboratori. La recerca biotecnològica ha mantingut l’ús tradicional que s’ha fet d’aquest llevat, tot millorant i innovant els processos de panificació i de producció de begudes alcohòliques. A la vegada, aquest organisme ha guanyat protagonisme al laboratori en convertir-se en un potent model biològic dels organismes eucariotes.

La seqüenciació completa del genoma de Saccharomyces cerevisiae –concretament, de la soca de laboratori S288C- es va finalitzar l’any 1996, després de quatre anys d'un projecte liderat per la Unió Europea i la participació de més de cent laboratoris de tot el món. Fou el primer organisme eucariota a ser seqüenciat i, avui, és el genoma eucariota més ben conegut.

El llevat és l’organisme més útil de la natura?

El microorganisme que dóna cos al pa

Saccharomyces cerevisiae és un llevat, és a dir, un fong unicel·lular, dins del grup dels ascomicets. Aquest grup inclou més de 60.000 espècies, entre elles les tòfones, les múrgoles o Penicillium, el fong que produeix la penicil·lina, però també fongs patogènics tant de plantes com d'animals, el més conegut dels quals es Candida. Es troba de manera espontània a la natura allà on hi ha substrats rics en sucres o als exsudats i sabes dolces d'algunes plantes. La paraula “llevat” (de "llevar" en l'accepció de pujar o aixecar) ens remet a l'experiència visual de la massa del pa que es "lleva" quan s'afegeix llevat a la farina. El seu nom alternatiu de "ferment" ve del llatí fervere, que vol dir bullir, i prové del moviment del most durant la producció de vi o cervesa. Els noms anglosaxons i germànics (yeast, Heffe) també es refereixen a l'acció de bullir o fer escuma. Per tant, el coneixement i percepció del llevat està absolutament condicionat per les seves propietats de fermentació al pa, vi o cervesa.

La cervesa i el pa foren el bitllet d’accés al laboratori del llevat?

Productes de la fermentació

L’interès alimentari de Saccharomyces cerevisiae és degut a la capacitat d’esponjar el pa i també pel producte final que s’obté de la fermentació alcohòlica (la cervesa i el vi). Aquest efecte es deu a la metabolització dels sucres de la massa o el most (essencialment glucosa, fructosa, sacarosa o maltosa) per donar diòxid de carboni i alcohol etílic o etanol. El primer és un gas que provoca que la massa del pa pugi (i les bombolles del cava), mentre que el segon és l'origen de les begudes alcohòliques. La fermentació dóna energia al llevat independentment de la presència o no d'oxigen, i consisteix en una reacció endògena d’oxidoreducció, a la qual la meitat de la molècula de sucre fa de donadora d'electrons cap a l'altra meitat.

Vida microscòpica

Saccharomyces cerevisiae és un organisme unicel·lular. De forma més o menys arrodonida, la cèl·lula presenta un nucli diferenciat i és, doncs, un organisme eucariota (en grec, eu- vertader; carion- nucli), com ho són també les plantes o els animals. Les cèl·lules de llevat es multipliquen ràpidament per gemmació, una forma asimètrica de reproducció asexual: a partir d’una cèl·lula s’origina una protuberància que va creixent i acaba donant lloc a una altra cèl·lula, més petita (al principi) que la cèl·lula inicial i diferenciada genèticament d'aquesta. Aquest tipus de reproducció, en condicions òptimes, dura unes dues hores i permet la colonització total dels mosts en qüestió d'hores o dies. Això és molt important en les fermentacions víniques, perquè hi ha competència d'altres fongs, llevats i bacteris que poden fer malbé el vi, i cal controlar molt bé les condicions i durada per evitar la proliferació d’aquests. Aquest ràpid creixement ha estat clau a l'hora de triar aquest llevat com eina per a la recerca i les aplicacions biotecnològiques.

Estratègies vitals

La bona vida no dura sempre, tampoc per al llevat, i això condiciona el seu cicle vital i estratègia reproductiva. En condicions òptimes, la fermentació explosiva i la reproducció asexual per gemmació representen uns avantatges evolutius, però quan l’aliment (o sigui, els sucres) s'esgota, l'estratègia ha de canviar. La primera adaptació és el pas d'un metabolisme fermentatiu a un de respiratori, en el qual els sucres, i l'etanol produït a partir d'aquests, són metabolitzats completament a diòxid de carboni amb consum d'oxigen, un procés molt més eficient que la fermentació, però també més lent. Aquest metabolisme oxidatiu del llevat és el principal causant de la maduració ("solera") dels vins de Xerès.

Estratègies vitals d’utilitat biotecnològica
En diverses aplicacions biotecnològiques és imprescindible controlar aquesta alternança entre metabolisme fermentatiu i respiratori. Si el que es vol produir és diòxid de carboni o alcohol, s'ha d'afavorir el metabolisme fermentatiu. En canvi, si el que es vol és massa de llevat o qualsevol producte cel·lular (proteïnes, polisacàrids i derivats, vitamines), les condicions més favorables es troben al metabolisme respiratori. En condicions encara més restrictives, el llevat segueix una estratègia típica de molts microorganismes eucariotes: entra en esporulació per donar lloc a formes resistents i de més variabilitat genètica. En el cas del llevat silvestre, aquest procés implica una meiosi, és a dir, el pas d'una dotació diploide (32 cromosomes) a una haploide (16 cromosomes).

Llevats que moren de vells
Davant la falta de nutrients, una resposta és l'apoptosi, la mort programada de les cèl·lules, amb un significat evolutiu no completament aclarit. Vol dir que les cèl·lules de llevat velles, és a dir, que ja han donat moltes cèl·lules filles (de 15 a 30 o 40, segons la soca) entren espontàniament en apoptosi sigui quina sigui la disponibilitat de nutrients. Aquest fet s’interpreta com una estratègia clonal de reciclatge de nutrients. Una altra estratègia davant la falta de certs nutrients és el creixement pseudohifal, pel qual el llevat es transforma en un organisme pluricel·lular que creix en forma de fils (hifes o pseudohifes) formant una teranyina. Tampoc es coneix el significat evolutiu d'aquest procés.

La sexualitat dels llevats

El cicle vital dels eucariotes que es reprodueixen sexualment alterna cèl·lules diploides (amb dues còpies de cada cromosoma, 2n) i haploides (una única còpia de cada cromosoma, n). Als animals, per exemple, la forma somàtica (l'animal tal com el veiem) és diploide, 2n, mentre que les cèl·lules sexuals, els gàmetes, són haploides, n, productes d'una meiosi. Durant la fecundació, els gàmetes es fusionen i donen un zigot diploide tot sumant les seves dotacions cromosòmiques respectives. A Saccharomyces cerevisiae existeixen les soques heterotàl·liques, que presenten formes vegetatives tant haploides com diploides, capaces ambdues de reproduir-se asexualment i de formar una colònia.

Cicle amb alternança de fases
El cicle vital complert del llevat comença amb una colònia diploide que, en circumstàncies de falta de nutrients, esporula per donar quatre espores haploides (dues "a" i dues "α"). A les soques heterotàl·liques, cada espora per separat pot germinar i donar lloc a una colònia haploide, que es reprodueix per gemmació de forma indefinida. Si es troben una cèl·lula "a" amb una "α", actuen com a gàmetes i es fusionen per donar lloc a un zigot que, posteriorment, germina i origina una colònia diploide. Aquest cicle presenta una complicació més, i és que, a la majoria de soques silvestres, les cèl·lules "a" i "α" es poden interconvertir l'una amb l'altra (homotal·lisme), un procés que se sol anomenar pel seu nom anglès "switch". A les soques homotàl·liques, una mateixa espora dóna lloc a un mescla de cèl·lules "a" i "α" i, donat que les cèl·lules diploides creixen més ràpidament que les haploides, originen sempre colònies diploides.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

Observació en fresc (llevats vius) per microscòpia òptica per contrast Nomarsky d'una soca de Saccharomyces cerevisiae, patentada, que s'utilitza per fer vi Albariño. Foto: cedida per a l'exposició por Dr. A.V. Carrascosa. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación CIAL (CSIC-UAM): http://www.ifi.csic.es

El llevat és un ésser viu

El pa, el vi i la cervesa són gairebé tan antics com la civilització; i les tècniques de fermentació quasi tan antigues com l’agricultura i la ramaderia. Entre els 7.000 i 3.000 anys aC es produïen begudes fermentades a la Xina, l’Iran o Egipte. Aquesta pràctica mil·lenària, durant molt de temps, es perfeccionà únicament des de la praxi perquè es desconeixia la raó científica de les transformacions. Amb la irrupció del món microscòpic, el llevat fou observat com a ésser viu i, al segle XIX, com a responsable d’algunes reaccions de fermentació. Fou així que el llevat entrà al laboratori. Però, més enllà de la química de la fermentació, aquest microorganisme assumí, al segle XX, un nou paper en esdevenir tècnica de laboratori.

Es pot produir fermentació sense llevat?

L’ull microscòpic

Antonie van Leeuwenhoeck (1632 – 1723), va realitzar, a finals de segle XVII, nombroses observacions amb els primers microscopis simples (d'una única lent) que ell mateix dissenyava. Tot i la simplicitat d’aquests instruments, va fer descripcions molt detallades –de fins a 200 augments- de tota mena de teixits i materials. Entre elles, figuren les primeres observacions de llevat, del qual digué que estava format d’una agrupació de glòbuls. La construcció de microscopis més perfeccionats, cap a mitjans de segle XIX, va permetre observar que les cèl·lules de llevat es multiplicaven per gemmació.

Els ferments

Des de finals de segle XVIII i durant el segle XIX, nombrosos químics s’interessaren per la naturalesa del ferment i el seu mode d’acció. Fou en aquella època que es començà a pensar que el “ferment” no era simplement una substància orgànica, com s’havia sospitat fins aleshores; fou llavors que es relacionaren els processos de producció de la cervesa (i altres fermentacions) amb els éssers vius i, més concretament, a ser entesos com el producte de microorganismes. La qüestió de la naturalesa del ferment es produí en el context del pensament vitalista i de la generació espontània i, doncs, estigué marcada per la controvèrsia.

La química de la fermentació
Antoine Lavoisier (1743-1794) estudià la reacció de la fermentació alcohòlica i publicà un llibre sobre “La fermentació del vi”. Lavoisier suggerí que el sucre fermentat es podia separar en dues parts, una que s’oxidava a diòxid de carboni i una altra que perdia oxigen i donava lloc a alcohol. Posteriorment, Charles Caignard-Latour (1777-1859) relacionà el procés de fermentació amb la naturalesa del ferment. Sostenia (correctament) que la descomposició del sucre i la seva conversió en diòxid de carboni i alcohol era una conseqüència del desenvolupament del llevat.

La naturalesa del ferment
Justus von Liebig (1803- 1873), químic alemany, considerà que les partícules de llevat podrien ser fongs, els gèrmens dels quals penetrarien en el líquid a fermentar a través de l’atmosfera. Des d’una postura mecanicista de la fermentació, suggerí que totes les reaccions realitzades dins dels éssers vius podien ser imitades en un tub d’assaig. Aquesta visió espontaneïsta l’enfrontà a científics com Louis Pasteur. D’altra banda, Charles Caignard-Latour, considerat el primer observador de la gemmació del llevat, sostingué que el llevat era una massa de cossos globulosos amb capacitat de reproducció i no una substància simplement orgànica o química com es creia.

Estudiar la cervesa

Durant la segona meitat de XIX, els científics de la naixent microbiologia, també s’interessaren per la qüestió de la fermentació. Louis Pasteur publicà l’any 1876 el llibre “Études sur la bière” que versava sobre aquest tipus de fermentació. Pasteur no parlà específicament de Saccharomyces cerevisiae ni prestà massa atenció en la taxonomia dels llevats. Però, l’estudi minuciós que feu dels diferents processos de producció de la cervesa, de les alteracions i la proposta de millores són una mostra de com aquest llevat va irrompre en l’escenari del laboratori.

La fermentació la fan les cèl·lules
Pasteur demostrà que la vida no es produïa per generació espontània. Per aquesta raó, sostingué de manera ferma que la fermentació la produïen els éssers vius i no agents estranys. No admetia que hi pogués haver fermentació alcohòlica sense que hi hagués organització, desenvolupament i multiplicació de les cèl·lules. Aquesta postura era l’oposada de la que defensà l’espontaneïsta von Liebig. Avui se sap, però, que tant els espontaneïstes com els vitalistes tingueren la seva part de raó en la interpretació del procés de fermentació.

Produir la fermentació

A principis de segle XX, Eduard Büchner (1860 - 1917) va aconseguir reproduir la fermentació alcohòlica en absència de cèl·lules de llevat i demostrar l’acció enzimàtica de la reacció. Büchner trencà les cèl·lules de llevat i afegí sucre als extractes. Al cap de poc temps, observà com es produia el procés de la fermentació i l’alliberament de bombolles de diòxid de carboni. D’aquesta manera, aconseguí separar la fermentació de l’activitat de les cèl·lules i resoldre un problema que venia de lluny. Aquesta recerca li va merèixer el Premi Nobel de Química l’any 1907. Es pot considerar que aquests experiments marquen el naixement de la bioquímica, ja que reprodueixen reaccions químiques pròpies dels éssers vius en un sistema lliure de cèl·lules. De fet, el terme enzim (en zymos) vol dir "al llevat".

De ferment a organisme model

Al segle XX, quan feia temps que el llevat circulava pel laboratori, es començà a utilitzar com a material per estudiar el funcionament de la cèl·lula eucariota. Es tractava d’un organisme unicel·lular que es podia cultivar fàcilment i acceptava sense massa inconvenients les tècniques de manipulació genètica i bioquímica. Més endavant, a la dècada de 1980, fou possible transformar les cèl·lules de llevat, és a dir, que incorporessin ADN que no els era propi. Això va permetre dissenyar cèl·lules que expressessin ADN d’altres organismes eucariotes i, entre d’altres, aquestes tècniques serviren per a la seqüenciació en els projectes genoma.

Llevat modificat genèticament
A la dècada de 1980, fou possible transformar les cèl·lules de llevat amb ADN recombinant de manera eficient. Les tècniques actuals permeten canviar el genoma de llevat pràcticament a voluntat. Es pot eliminar, duplicar, reemplaçar o modificar qualsevol gen del llevat sense afectar la resta del genoma de manera substancial. De fet, i portant la tècnica a l'extrem, és tècnicament possible canviar qualsevol dels 12 a 14 milions de parells de bases d’ADN deixant la resta del genoma intacte. La facilitat amb què es poden eliminar o reemplaçar gens concrets en el llevat ha estat un avantatge per a l’experimentació.

Cromosomes artificials
La transformació "clàssica" del llevat, que implica bé inserir el fragment d’ADN forà a un dels cromosomes del llevat o incorporar-lo a un plasmidi autoreplicatiu (fragment d’ADN circular que es replica de manera independent al cromosoma), té uns límits relativament fixes quant a mida d’ADN incorporat, típicament d'uns milers de parells de bases (quilobases, Kb). El coneixement del funcionament dels cromosomes de llevat ha fet possible fer autèntics cromosomes artificials o YAC (Yeast Artificial Chromosomes), capaços d’incorporar entre cent i milers de Kb, una mida comparable als cromosomes naturals del llevat. Aquesta tècnica ha estat fonamental als projectes de seqüenciació de genomes d'altres espècies, inclosa la humana.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

Pictografia proto-cuneïforme que enregistrava la producció de la cervesa. Probablement del sud de l'Iraq, fa uns 3100-3000 aC. © Trustees of the British Museum: http://www.britishmuseum.org

Saccharomyces laboratoriae

Malgrat els 1.000 milions d'anys de divergència evolutiva, més d'una tercera part dels gens del llevat es troben també a humans (són homòlegs) i, en molts casos, fan funcions semblants (són ortòlegs). D'aquests, desenes, si no centenars, corresponen a gens relacionats amb malalties hereditàries, metabòliques o amb el càncer. La similitud entre el sistemes cel·lulars fonamentals (divisió cel·lular, cromosomes, resposta a estrès i metabolisme primari, entre d'altres) de llevat i d'animals superiors ha consolidat el llevat com model d'eucariota, a nivell cel·lular i molecular. A la vegada, ha demostrat un enorme potencial com a tecnologia per a la biologia molecular al permetre establir amb relativa facilitat la relació entre l’estructura genètica i la funció de la proteïna.

Un llevat pot modelitzar altra cosa que no siguin llevats?

Biotecnologia de l’aroma

Els processos de fermentació en la fabricació del vi i la cervesa són objecte de continues millores i innovacions des de l’àmbit biotecnògic. En aquest sentit, l’aroma, que és una qualitat del vi, és una de les dianes a les quals es dirigeix la recerca actual en fermentació. Hi ha un ampli espectre de compostos aromàtics en el vi, inclosos els compostos que sintetitza de nou el llevat com a producte de la fermentació. Un dels objectius en aquest camp és guanyar coneixement en les xarxes de gens que intervenen en la síntesi de l’aroma producte de la fermentació.

Model cel·lular

El llevat és un organisme format per una sola cèl·lula. Aquesta cèl·lula té una estructura eucariota, que vol dir que té el material genètic (les instruccions que necessita per viure) recollit dins del nucli. Els organismes pluricel·lulars com les plantes o els mamífers també tenen cèl·lules eucariotes. El llevat ha esdevingut un model útil per a estudiar la biologia dels eucariotes pel fet de ser unicel·lular i eucariota. De fet, la major part del coneixement que es té avui sobre el control de cicle cel·lular (eucariota) prové de la recerca amb el llevat.

Ser microorgranisme
El fet de tractar-se d’un microorganisme fa que el llevat comparteixi amb els bacteris la simplicitat i rapidesa de creixement. A més a més, en un organisme unicel·lular és possible aplicar amb relativa facilitat els mètodes de la genètica i bioquímica clàssica, i també les tecnologies moleculars. De fet, amb l’ús de tecnologies d’ADN recombinant s’ha pogut constatar que les proteïnes dels eucariotes estan molt conservades en la seqüència d’aminoàcids al llarg de l’escala evolutiva.

Ser eucariota
El fet de ser un eucariota fa que comparteixi moltes de les propietats fonamentals de la biologia cel·lular dels organismes pluricel·lulars més complexes (citoesquelet, orgànuls subcel·lulars, regulació metabòlica, etc.). Això fa que es pugui estudiar en el llevat determinats aspectes de la biologia dels eucariotes, a un nivell cel·lular i molecular, com són la funció i regulació dels gens. Altres qüestions que afecten a la diferenciació cel·lular per formar els teixits o que tenen a veure amb malalties, han de ser estudiades en models pluricel·lulars.

Un genoma compacte

Al genoma del llevat més del 75% són gens que codifiquen proteïnes o zones reguladores de la seva expressió, és a dir, que determinen l’abundància de les proteïnes en funció de les condicions cel·lulars i del medi. En total, són uns 12 milions de parells de bases (12 Mb), repartits en 16 cromosomes (dotació haploide) als quals s'han d'afegir 1 o 2 Mb més (depenent de la soca) que codifiquen pels ARN ribosomals. S'han descrit uns 6.000 gens, dels quals es coneix la funció d'un 30-50%. Aquest números prenen sentit quan es comparen amb els corresponents al genoma humà: 23 cromosomes (dotació haploide), 3.000 Mb, 23-25.000 gens. Aquesta fou la primera sorpresa de la comparació d'ambdós genomes: els humans només tenen quatre vegades més gens que el llevat encara que repartits en un oceà d’ADN, 500 vegades major que el genoma de llevat.

El llevat com a tecnologia

Més enllà del seu interès com a organisme, el llevat ha esdevingut la base d’algunes eines de laboratori àmpliament utilitzades. Així, serveix per clonar i expressar gens gràcies als cromosomes artificials del llevat. També ha permès generar una col·lecció de mutants per a cada un dels seus 6.000 gens que permet analitzar la funció dels gens (genòmica funcional), molt útil per a conèixer la funció de gens homòlegs en altres espècies i en els humans. També s’han desenvolupat altres tècniques que utilitzen el llevat, com la tècnica “two-hybrid” per cercar les interaccions proteïna-proteïna (Yeast Two-Hybrid, Y2H), útil per a la recerca proteòmica; i com les tècniques de gran productivitat (high-throughput) per a obtenir dades sobre el transcriptoma (conjunt de molècules d’ARN missatger que s’expressa en una cèl·lula, teixit o organisme) o per detectar l’acció d’un ampli ventall de molècules candidates per al disseny de fàrmacs.

El llevat humanitzat

Un aspecte fonamental de la utilització del llevat com model és la possibilitat "d'humanitzar-lo". Amb això el que es vol dir és que s'introdueixen al llevat gens humans, o es reemplacen els gens propis pels seus ortòlegs humans, per tal d'estudiar el seu funcionament. Aquesta estratègia té moltes aplicacions. Per exemple, la indústria farmacèutica usa soques de llevat que expressen gens humans per al disseny de nous medicaments que interaccionen amb el producte d’aquests gens (un inhibidor d’un enzim o un lligand per un receptor). Poder analitzar els efectes fisiològics en un microorganisme com el llevat facilita molt les etapes primàries de desenvolupament de fàrmacs.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

Membrana de la cèl·lula de llevat visualitzat per algunes proteïnes de membrana que s'han fusionat amb marcadors fluorescents (RFP i GFP). El color groc resulta de la superposició de la llum d'ambdós marcadors. Foto: Masur. Font: Wikimedia Commons. Aquesta imatge està sota llicència Creative Commons Reconeixement i Compartir igual 3.0 No adaptada (CC BY-SA 3.0).

L’any 1996 es va obtenir la seqüència del genoma del llevat de la cervesa, Saccharomyces cerevisiae i és encara el genoma eucariota més ben conegut, tant pel que fa a aspectes estructurals (variabilitat, estructura dels telòmers i centròmers, transposons) com funcionals (estructura i disposició dels gens, promotors, etc.). Els 12 milions parells de bases del seu genoma contenen prop de 6.000 gens dels quals es coneix la funció de pràcticament tots ells. És unes quatre vegades més gran que el genoma d’Escherichia coli i unes dues-centes vegades més petit que l’humà. L’any 2002, es va seqüenciar el genoma d’un altre llevat, Schizosaccharomyces pombe, que també s’utilitza força al laboratori. La comparació entre ambdós genomes, i d’altres nous que apareixen, permet establir convergències i divergències en l’estructura i funció d’aquests.

7000 – 3000 aC

Evidències de la producció de begudes fermentades a la Xina, l’Iran o Egipte.

1680

Antoine Leeuwenhoek fa les primeres observacions microscòpiques del llevat.

1800s

S’associa el llevat amb la fermentació alcohòlica.

1876

Louis Pasteur publica els “Études sur la bière” sobre els processos de producció de la cervesa.

1883

Eduard Büchner reprodueix la fermentació alcohòlica sense cèl·lules de llevat i obté alcohol i diòxid de carboni.

1949

Primer mapa genètic de Saccharomyces cerevisiae.

1978

Primera transformació de Saccharomyces cerevisiae.

1987

Es creen els cromosomes artificials de llevat (YAC, sigles en anglès) com a vectors d’expressió de gens.

1993

Mapa general de l’ADN humà obtingut gràcies a la tècnica dels YAC.

1996

Seqüenciació del genoma de Saccharomyces cerevisiae.

2001

Hartwell i Nurse comparteixen el Premi Nobel de medicina pels seus estudis en el cicle cel·lular del llevat.

2002

Seqüenciació del genoma del llevat Schizosaccharomyces pombe.