Consell Superior d'Investigacions Científiques (CSIC). Delegació de Catalunya.

Potser l'ésser viu més conegut

L'organisme més conegut en l'esfera científica és, segurament, un bacteri que habita l'intestí humà. Encara que invisible a simple vista, a ell, Escherichia coli, es deu en gran mesura el coneixement d'alguns dels fonaments de la biologia moderna que han merescut el reconeixement de diversos premis Nobel. Es tracta dels processos de recombinació genètica dels bacteris, de transcripció de l'ARN, de replicació de l'ADN i de regulació gènica. Aquest bacteri, a més a més, s'ha convertit, en les últimes dècades, en un instrument més del laboratori, sobretot en el camp de la biologia molecular.

El seu genoma va ser seqüenciat el 1997 i conté la setena part de gens que l'ésser humà.

No és sorprenent que un bacteri pugui dir tantes coses de la resta d'éssers vius?

La vida diària d'un bacteri intestinal

El bacteri més popular de la biologia viu, en condicions naturals, a l'interior del cos d'aus i mamífers. Escherichia coli, de forma abreujada E. coli, habita a l'intestí humà al costat de diversos centenars d'altres espècies de bacteris. Tots ells formen la microbiota intestinal, coneguda col·loquialment com a "flora intestinal". En condicions normals, E. coli és beneficiós per al cos humà però, de vegades, es troba fora de l'intestí i pot ocasionar infeccions de major o menor gravetat. Algunes de les soques han adquirit gens que codifiquen toxines i poden produir infeccions greus. Molts bacteris freqüenten els mateixos ambients que Escherichia coli i poden causar infeccions en les persones.

Com va aconseguir aquest bacteri ser el més conegut del laboratori?

Els microbis de l'intestí

La microbiota de l'intestí humà és un ecosistema de microbis que ajuda en la digestió dels aliments i té una funció defensiva davant de patògens. E. coli s'instal·la al tracte digestiu quan l'ésser humà té tot just uns mesos i, amb pocs anys, s'estableix un equilibri que es manté al llarg de la vida. No és l'espècie més abundant, però sí una de les principals, i normalment es troba a l'intestí gros.

Una cèl·lula microscòpica

E. coli és una cèl·lula d'unes poques micres (una micra és la mil·lèsima part d'un mil·límetre) amb forma de bastonet. Es pot moure gràcies als flagels, unes llargues i fines extensions al voltant del cos. Com tots els bacteris, l'estructura de la cèl·lula és de tipus procariota, és a dir, no té un nucli diferenciat; té un únic cromosoma que es troba distribuït per tot el citoplasma. A la part externa té una paret que està formada per dos membranes (interna i externa) i entre les dues una capa que dóna rigidesa a la cèl·lula, el peptidoglicà.

Prescindir de l'oxigen

E. coli forma part de la família de les enterobacteriàcies (enteron- en grec significa intestí). En aquesta família els bacteris poden viure sense oxigen i obtenen energia gràcies a la fermentació dels sucres. En determinats casos, són capaços de viure en presència d'oxigen. Es diu que els bacteris que poden prescindir de l'oxigen o que l'utilitzen en funció de les condicions, tenen un metabolisme anaeròbic facultatiu.

Causa d'infeccions

De vegades, el bacteri E. coli pot habitar parts menys habituals de l'intestí i, fins i tot, fora d'ell. Quan ho fa, sovint, es tracta de soques que causen infeccions. La diarrea severa que pateixen molts nens sol estar produïda per soques patògenes d'E. coli. La cistitis aguda i la infecció enterohemorràgica són altres afeccions que pot causar aquest bacteri. La freqüència d'alguna d'aquestes infeccions explica que fossin soques aïllades de malalts les primeres que entressin al laboratori. Avui en dia, pel seu cultiu prolongat fora del cos humà, les soques utilitzades en els laboratoris han perdut la seva capacitat infecciosa.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

E. coli escrit amb bacteris Escherichia coli en un medi MacConkey. Foto: Mercè Berlanga. Departament de Microbiologia i Parasitologia Sanitàries de la Facultat de Farmàcia de la Universitat de Barcelona. http://www.ub.edu/mips/welcome.html

El bacteri que va canviar el curs
de la biologia

E. coli no és l'únic bacteri que s'utilitza al laboratori però és el més conegut entre els investigadors de ciències de la vida. Va entrar al laboratori, al costat de molts altres bacteris, a la fi de segle XIX, l'època en què s'estava desenvolupant la bacteriologia (ciència que estudia els bacteris), i es començava a descriure la riquesa de formes de vida microscòpica. En aquella època, el principal interès d' E. coli estava relacionat amb les infeccions que causava. Va ser, sobretot, a partir de mitjan segle XX que es va convertir en un model biològic i permetre trobar alguns dels principis bàsics de la vida. Però, el que va fer cèlebre a E. coli va ser el descobriment d'una tècnica, de "talla i enganxa" de l'ADN, que permet seleccionar i construir seqüències d’ADN a voluntat dels investigadors, que va canviar per sempre la biologia.

Es pot disseccionar un bacteri?

Estudiar un bacteri infecciós

L'abundància d'espècies bacterianes que s'estudien actualment al laboratori es deu a la llarga tradició bacteriològica de finals de segle XIX. E. coli, inicialment, es va denominar Bacterium coli i se’l va descriure com el bacteri comú del còlon. El seu nom actual fa memòria al seu descobridor, Theodor Escherich (1857-1911), un reconegut pediatre alemany que, com altres membres de la seva disciplina, es va interessar pels bacteris perquè estaven estretament relacionats amb les infeccions infantils.

Bacteris i tubs d'assaig

A mitjan segle XX, alguns investigadors van començar a veure que els bacteris tenien la senzillesa necessària que permetria trobar els principis fonamentals de la vida. La seva estructura és més senzilla que les nostres cèl·lules, el seu creixement, ràpid, i es podia emprar diferents mitjans per al seu cultiu en el laboratori, la qual cosa afavoria les possibilitats experimentals. En aquest context, investigacions amb nombrosos bacteris van permetre trobar resultats que es mantenen vigents en l'actualitat.

Mecanismes bàsics de la vida
Avui se sap que el material genètic és l'ADN (àcid desoxiribonucleic), que es replica i passa com a herència a les cèl·lules filles; també es transcriu i es tradueix per produir totes les proteïnes que la cèl·lula necessita per funcionar. Aquests són alguns dels principis fonamentals de la vida que avui apareixen en tots els llibres de text i poden semblar gairebé obvis. Però, lluny de ser evidents, es van obtenir a les palpentes, utilitzant bacteris, tubs d'assaig i enginyoses, i de vegades desgavellades, hipòtesi d'alguns investigadors brillants.

L'ADN és el material genètic
Alguns bacteris han permès realitzar troballes de major transcendència, potser, que l'E. coli. A la dècada de 1940, el bacteri Streptococcus pneumoniae va permetre deduir que el material genètic era l'ADN i no les proteïnes.Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn MacCarty va comprovar experimentalment, l’any 1944, una observació de Frederick Griffith feta el 1928. Infectaren ratolins amb una soca patògena del bacteri, que produïa pneumònia, i una altra que no emmalaltia. Van descobrir que podien convertir els bacteris inofensius en patògens i aquesta propietat es transmetia als descendents. En analitzar les possibles molècules responsables, l'agent infecciós resultà ser l'ADN i es va posar fi a una controvèrsia de principis de segle XX.

Sexe entre bacteris
Pels voltants de 1950, Edward Lawrie Tatum i Joshua Lederberg van dur a terme uns experiments per veure si els bacteris intercanviaven informació genètica i si existia reproducció sexual. Van utilitzar mutants de la soca K12 d'E coli que no eren capaços de sintetitzar un aminoàcid (triptòfan) i que per a sobreviure necessitaven obtenir-lo del medi de cultiu. Els van posar en contacte amb bacteris no mutants de la mateixa soca que sí que sintetitzaven aquest aminoàcid i, al cap d'un temps, algunes de les primeres podien sintetitzar el triptòfan. Això va demostrar que s'havia produït una transferència d'informació d'uns bacteris a altres, en un fenomen que ara es coneix com conjugació.

Copiar l'ADN
L’any 1957, Matthew Messelson i Franklin Stahl van fer un experiment que va confirmar que la replicació de les cadenes d'ADN tenia lloc segons el model semiconservador proposat per James Watson i Francis Crick. Per a això, van cultivar durant diverses generacions bacteris d'E. coli en un mitjà que com a única font de nitrogen tenia l'isòtop 15. L'ADN sintetitzat en presència d'aquest isòtop pesat és de major densitat que el que es produeix quan es sintetitza a partir de l'isòtop normal, el nitrogen 14. Després es va passar a cultius en què el nitrogen era normal (isòtop 14) i es van prendre mostres després de diversos temps en que les cèl·lules havien crescut i el seu ADN, que contenia l'isòtop pesat, s'havia replicat amb isòtop normal. Observaren que després d'una replicació l'ADN resultant tenia una densitat intermèdia i que quan havien passat dues replicacions apareixia ADN de densitat lleugera juntament amb el de densitat intermèdia. Així van deduir que la replicació és semiconservativa: cadascun dels brins de la doble hèlix s'utilitza de motlle per a ser copiada però es manté íntegra. És a dir, que per obtenir dues cadenes dobles cada cadena de l'ADN es copia però no s'allarga ni se li s'intercalen elements.

Dissecció d'un bacteri

A mitjan segle XX, es van realitzar alguns dels experiments més rellevants amb E. coli; els quals han permès saber que els bacteris són capaços d'intercanviar la informació genètica, que la informació de l'ADN es transcriu produint un ARN (àcid ribonucleic) missatger, a partir del qual els ribosomes poden interpretar el codi genètic i sintetitzar proteïnes i també descriure un mecanisme de regulació de l'activitat dels gens en els bacteris. Però el descobriment que va catapultar a E. coli al cim dels organismes de laboratori va ser el descobriment dels enzims de restricció cap a la dècada de 1970, que va obrir les portes a l'enginyeria genètica.

Missatgers Moleculars
E. coli va estar involucrat, a principis de la dècada de 1960, i de la mà de Sydney Brenner, François Jacob i Jacques Monod en el descobriment de l'existència de l'ARN missatger que era l'encarregat que la informació genètica del nucli arribés als ribosomes del citoplasma per ser traduïda a proteïnes. Cada gen o conjunt de gens es transcriu a ARN, el qual conté la mateixa informació que una de les cadenes de l'ADN. Aquesta informació està en el llenguatge dels àcids nucleics, que consta de 64 paraules en forma de triplets de bases nucleiques. Ha de ser interpretada en els ribosomes i s’ha de traduir al llenguatge de les proteïnes, en què les paraules són 20 aminoàcids diferents. L'equivalència entre els 64 triplets de bases i els 20 aminoàcids és el "codi genètic".

Model operó: regulació dels gens
François Jacob i Jacques Monod descrigueren un model que regula l'activitat dels gens en els bacteris, al que van denominar model operó. Es tracta d’una unitat genètica funcional formada per un grup o complexe de gens que regulen una via metabòlica o una determinada funció cel·lular. El complexe és capaç de regular la pròpia expressió de gens en funció de la interacció amb els substrats del medi cel·lular. Generalment, aquests gens estan regulats per una seqüència anomenada promotor, que és on s'inicia la transcripció per sintetitzar un ARN missatger. A continuació del promotor pot existir una regió de control, anomenada operador, a la qual s'uneixen proteïnes que impedeixen (repressor) o activen (activador) la transcripció i que es modulen en funció de les condicions que hi ha en un deteminat moment al bacteri. L'operó lac (lactosa), que regula el metabolisme de la lactosa, fou el primer mecanisme regulatori de l’expressió gènica a ser elucidat i és un exemple clàssic de regulació gènica en procariotes. Quan no hi ha lactosa en el medi de cultiu l'operó està reprimit perquè una proteïna repressora, el repressor Lac, s'uneix a la regió operadora i impedeix que progressi la transcripció. En presència de lactosa, un derivat d'ella s'acobla al repressor i allibera l'operador. Això permet la transcripció dels gens LacZ, LacY i LacA, i les tres proteïnes que es sintetitzen fan que la lactosa pugui ser introduïda en la cèl·lula i metabolitzada. Quan ja no existeix més lactosa el repressor torna a ser actiu i s'uneix a l'operador, tornant així a l'estat inicial.

L'enzim que fa créixer el ADN
A mitjans de la dècada de 1950, Arthur Kornberg va realitzar experiments amb E. coli per estudiar com es copiaven els brins d'ADN. Va observar que hi havia d'haver un segment d'ADN que actués com a motlle i un extracte on devia trobar-se l'enzim responsable: DNA polimerasa. També va poder verificar que els dos brins són antiparal·lels i que l'ADN sempre és polimeritzat des de l'extrem 5' a 3' (com es proposava en el model de Watson i Crick). Més tard es va veure que aquesta enzim no és la que realitza la replicació de l'ADN en la cèl·lula sinó que en aquestes condicions té activitat 3' a 5' (exonucleasa) i serveix per corregir errors de l'ADN ja replicat.

Tallar l'ADN com a protecció
A la dècada de 1960, Werner Arber analitzà detalladament el fenomen de la restricció en E. coli, amb el qual els bacteris, per protegir-se dels virus que els infecten, tallen l'ADN d'aquests virus. Va postular que els bacteris utilitzen enzims propis que tallen per llocs específics dins de la seqüència d'ADN per intentar eliminar l'ADN víric que ha penetrat en la cèl·lula. Els va anomenar enzims de restricció. El 1970, Hamilton Smith va aïllar el primer enzim d'aquest tipus en el bacteri Haemophilus influenzae, HindIII. La capacitat de tallar la seqüència d'ADN de manera específica ha permès fer mapes genètics de molts organismes i establir les bases de la manipulació genètica.

Tallar l'ADN amb un propòsit
A principis de la dècada de 1970, el grups de Peter Lobban i Dale Kaiser i el de Paul Berg van realitzar dos experiments pioners en la recombinació genètica utilitzant enzims de restricció. La idea d'ambdós grups era crear un plasmidi (fragment d'ADN circular més petit que el cromosoma bacterià que es replica independentment) i inserir-lo en el bacteri E. coli. En el primer cas, el plasmidi es va construir amb el gen de la insulina mentre que, en el segon, va ser amb lacZ, un gen de l'operó lactosa. Per introduir el plasmidi artificial en el bacteri van utilitzar una alta concentració de clorur de calci que permeabilitza les membranes del bacteri, un procediment que havia desenvolupat Morton Mandel. L'enzim EcoRI, una de les primeres que es van descobrir i purificar és una de les més utilitzades, però en l'actualitat hi ha una gran diversitat d'enzims de restricció que faciliten als investigadors la manipulació de l'ADN en el tub d'assaig. D'altra banda, el 1973 Herbert Boyer, Stanley Cohen i col·laboradors van desenvolupar tècniques per a usar plasmidis com a vectors per a clonar gens forans. Pocs anys després es creà la primera empresa de biotecnologia, Genentech.

Imatges

Anar a galeria multimèdia

Edward L. Tatum a la Universitat d'Stanford. c.1940. http://www.rockarch.org Gentilesa del Rockefeller Archive Center.

De model... a instrument de laboratori

Avui, la investigació sobre E. Coli manté el seu interès per les infeccions que causa. En els darrers anys, s'ha detectat una major resistència als antibiòtics de certes soques d'aquest bacteri. Aquestes adquireixen gens d'altres bacteris o modifiquen algun dels seus per tal que l'antibiòtic sigui degradat, inactivat, expulsat o perquè l'activitat de l'antibiòtic es modifiqui i no serveixi. Per aquest motiu, s'està treballant per conèixer bé els mecanismes que es posen en marxa quan la cèl·lula es divideix, i al costat de les tècniques genòmiques, dissenyar fàrmacs que siguin més específics. Més enllà de la investigació sobre el propi bacteri, E. coli s'ha convertit en un instrument més de laboratori, al costat de les pipetes i els tubs d'assaig.

Quin és el nombre mínim de gens que es necessita per viure?

Malalties emergents

Durant el segle XX, els antibiòtics van permetre combatre de manera efectiva moltes malalties infeccioses causades per bacteris. Però, des de fa uns anys, s'ha detectat un augment de les resistències als antibiòtics. Per exemple, als països desenvolupats, aquestes són la causa de més del 50% de les malalties contretes a l'hospital. Aquest fet, juntament amb l'aparició de noves malalties infeccioses, pot tenir un impacte social i econòmic important, la qual cosa planteja la necessitat de dissenyar nous fàrmacs antimicrobians.

Quan el bacteri està fora de lloc
Les infeccions del tracte urinari, la meningitis en nounats, la sèpsia abdominal o la septicèmia, que és una afecció generalitzada greu que arriba a la sang, són algunes de les malalties infeccioses provocades per soques de E. coli que es troben fora de l'intestí (ExPEC, Extraintestinal pathogenic E. coli). Aquestes afeccions que fins fa poc eren casos mèdics localitzats, en els darrers anys, estan convertint-se en un problema creixent per a la salut humana.

Ser resistent a un antibiòtic
Els bacteris que són sensibles a un antibiòtic no poden viure en un medi on hi hagi aquesta substància, mentre que si són resistents poden viure-hi sense problema. La resistència a un antibiòtic sol estar en un gen del bacteri. De vegades, els bacteris que tenen el gen el poden passar a altres bacteris, a través de la conjugació, transferint la capacitat de resistència. Un bacteri també es pot tornar resistent si pateix una mutació en aquest gen.

Atacar la divisió de la cèl·lula

En condicions òptimes de cultiu en el laboratori, als vint minuts de vida, el bacteri es divideix per donar dues cèl·lules noves. Per a dividir-se, la cèl·lula creix fins a duplicar la grandària que tenia a l'inici, després es constreny per la part del centre, i al final se separen les dues cèl·lules. Aquest procés ha estat molt estudiat en E. coli i, ara, se sap que està regulat de manera molt fina per més d'una quinzena de gens. Conèixer el paper que tenen aquests gens pot permetre dissenyar fàrmacs que actuïn sobre la maquinària de divisió del bacteri i impedeixin que es reprodueixi. D'altra banda, aquest coneixement pot també contribuir al desenvolupament de la recent biologia sintètica, que crea vida artificialment en el laboratori.

Ordre i control en la divisió
En E. coli, el procés que ha de separar les dues cèl·lules filles mitjançant la formació d'un envà central està controlat per almenys quinze gens que codifiquen per a les corresponents proteïnes. Just abans que comenci a formar-se l’envà, al centre, les quinze proteïnes s'acoblen de forma coordinada per formar un anell, que indica el lloc de divisió i té un paper crucial en la correcta formació de l'envà. Per conèixer l'acció de les proteïnes, els investigadors construeixen bacteris mutants que no tenen una d'aquestes proteïnes, i el seu estudi dóna algunes pistes de la funció que ha quedat afectada.

Crear éssers semblants a bacteris
El 2010, es va donar a conèixer la creació del primer ésser viu sintètic, Mycoplasma laboratorium, creat per l'Institut J. Craig Venter. Aquest bacteri té al voltant d'uns 400 gens i és molt més simple que E. coli que en disposa d'uns 4.000. Es tracta d’un pas significatiu cap a la creació de vida artificial. També permet donar una resposta sobre el nombre mínim de gens necessaris per viure, que estaria entre els 200 i 500 gens. Una troballa, les implicacions ètiques de la qual, en termes de beneficis i riscos potencials per a la societat, convindria abordar.

Gens i medi ambient

Actualment s’investiga l'expressió gènica global d'Escherichia coli creixent en diferents fonts de carboni. S’ha detectat que quan disminueix la qualitat del substrat de carboni, les cèl·lules sistemàticament augmenten el nombre de gens expressats. La inducció de gens es produeix d'una manera jeràrquica i inclou factors per a una millor absorció i metabolisme de les fonts de carboni. Al mateix temps, les cèl·lules augmenten la seva mobilitat. Així, a mesura que el potencial de creixement del medi ambient disminueix, les cèl·lules semblen dedicar cada vegada més energia en la possibilitat de millorar les condicions; la qual cosa no s’explica simplement amb els models clàssics de regulació.
E.coli Genome Project (University of Wisconsin-Madison) – Functional genomics

Instrument de laboratori

Els investigadors utilitzen E. coli per "tallar i enganxar" gens, en protocols rutinaris de la vida diària de molts laboratoris, que no tenen res a veure amb l'estudi del bacteri. La idea és la següent: es tallen un fragment d'ADN que interessa i un plasmidi (ADN circular) d'E coli amb els mateixos enzims de restricció. Els extrems de les dues seqüències d'ADN són complementaris i es poden fusionar. El plasmidi construït sol portar també una seqüència de resistència a un o diversos antibiòtics. S'introdueix en el bacteri mitjançant un xoc elèctric o osmòtic. S'afegeixen els antibiòtics en el medi i es seleccionen els bacteris que han incorporat el plasmidi artificial amb els gens desitjats.

Video

Anar a galeria multimèdia

Video de la mobilitat d'Escherichia coli sobre diferents substrats de carboni. Gentilesa de Guy Plunkett. Wisconsin University - Madison. http://www.genome.wisc.edu/functional.htm

Imatges

Cèl·lules que sobreexpressen una proteïna ZipA a la qual li falta el domini transmembrana, després d'haver afegit l'inductor arabinosa durant 60, 90 i 150 minuts. En els tres temps lès cèl·lules estan incubades amb un anticos primari anti-His i posteriorment amb un anticos secundari fluorescent Alexa-488 que dóna un color verd i les mateixes cèl·lules incubades amb un anticos primari anti-ZipA i posteriorment amb un anticos secundari fluorescent Alexa-594 que dóna un color vermell. Les fotos són un solapament de les dues imatges. Foto: Pilar Palacios. Gentilesa del Centre Nacional de Biotecnologia (CSIC)

El genoma del bacteri E. coli va ser seqüenciat el setembre de 1997 a la Universitat de Wisconsin a Madison, Estats Units. Anteriorment, s'havien seqüenciat altres genomes de bacteris com Haemophilus influenzae (1995), Mycoplasma genitalium (1995), Methanoccocus jannaschii (1996) i Helicobacter pylori (1997). No obstant això, l'obtenció de la seqüència genòmica completa E. coli, concretament de la soca K-12, va ser una fita clau perquè és l'organisme més conegut del planeta. La seqüència està disponible a Internet, conté 4.639.221 parells de bases (4,6 Mb) amb prop de 4.300 gens, dels quals es coneix la funció de dos terços d’ells.

1886

Theodor Escherich descobreix el bacteri Bacterium coli, que més tard s’anomenà Escherichia coli (E. coli).

1946

Joshua Lederberg i Edward Tatum demostren l'existència de conjugació en E. coli.

1955

François Jacob i Elie Wollman demostren l'existència del plasmidi F en E. coli.

1961

François Jacob i Jacques Monod descriuen el primer exemple de control de l'expressió dels gens amb model de l'operó.

1960s

Werner Arber estudia el fenomen de la restricció en E. coli.

1970

Daniel Nathans i Hamilton Smith descobreixen els enzims de restricció, essencials per al desenvolupament de l'enginyeria genètica.

1971

Peter Lobban, Dale Kaiser i Paul Berg desenvolupen de manera paral·lela les tècniques de recombinació genètica, utilitzant E. coli.

1973

Herbert Boyer, Stanley Cohen i col·laboradors desenvolupen tècniques per utilitzar plasmidis com a vectors per a clonar gens forans.

1976

Herbert Boyer i Robert Swanson creen la primera empresa de biotecnologia, Genentech.

1979

Es produeix insulina humana usant E. coli mitjançant tècniques d'enginyeria genètica i es comercialitza l’any 1982.

1997

Seqüenciació del genoma d'E coli.